Roepat Str - Historia

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Roepat

(Estructura: dp. 16,100; 1. 466'0 ", b. 55'11", dr. 28'9 ", s. 11 k .; cpl. 70; a. 1 5", 1 3 ")

Roepat (Id. No. 2536), construido en 1914 por William Hamilton & Co., Ltd., Glasgow, Escocia, para su servicio como barco de transporte de animales Duteh, fue incautado por funcionarios de aduanas de EE. UU. Buque de servicio de transporte 17 de mayo de 1918 en Nueva York.

Después del reacondicionamiento y el reacondicionamiento, Roepat cargó una cantidad de suministros generales del ejército y navegó el 2 de junio en un convoy hacia Brest y St. Nazaire, donde descargó su cargamento. Regresó a Nueva York en convoy el 30 de julio.

Cargando suministros del ejército en Norfolk, zarpó en convoy desde Nueva York el 17 de agosto hacia Marsella, donde llegó el 6 de septiembre para descargar su cargamento. Regresó a Nueva York el 18 de octubre para someterse a reparaciones y cargar cargamento del Ejército para Verdon, a donde llegó el 18 de noviembre. Regresó a Norfolk el 22 de diciembre.

Al cargar un cargamento para la cuenta de la Junta de envío en Baltimore, se refugió en Nueva Orleans y zarpó desde este último puerto el 5 de febrero de 1919 hacia Cette a través de Newport News. Al desembarcar su cargamento de trigo y grano consignado al gobierno suizo el 4 de marzo, regresó a Nueva York el 6 de mayo y se sometió a reparaciones.

Roepat zarpó el 24 de mayo hacia Portland, Maine, donde cargó un cargamento para el Shipping Board y zarpó el 29 hacia Amsterdam, donde llegó el 28 de junio. El 30 de junio, Roe pat fue puesta fuera de servicio y devuelta a su propietario, Nederland Stoomvaart Maats chappij.


Introducción a la repetición corta en tándem

Espero que todos estén sanos y salvos durante estos tiempos desafortunados. Mi último puesto fue en relación a ser un nuevo graduado de MLS y comenzar mi carrera como tecnólogo molecular en el Laboratorio de Trasplantes de la Universidad de Northwestern. ¡El tiempo definitivamente pasa volando!

Hoy voy a ofrecer una introducción básica sobre un ensayo en el que me capacitaron recientemente, llamado Short Tandem Repeat (STR). Si echaras un vistazo a tu genoma, estaría plagado de muchas secuencias repetidas. Si bien existen muchas clasificaciones diferentes de secuencias repetidas, los STR son un tipo de secuencia repetida en tándem donde cada repetición tiene aproximadamente 2 a 7 nucleótidos de longitud. 1,2,3 STR es bien conocido en la ciencia forense por ayudar a identificar a un sospechoso en la escena del crimen cuando existen diferentes fuentes de ADN. Sin embargo, sus aplicaciones son muchas, desde la confirmación de la línea celular, las pruebas paternas y hasta el análisis de quimerismo. 4

Imagen 1. Electroferograma que muestra dos alelos diferentes (11 y 17) dentro de 1 locus (D6S1043). El alelo 11 tiene 11 repeticiones y el alelo 17 tiene 17 repeticiones.

Los STR son polimórficos, una característica útil entre muchas, que hacen que su utilización para identificar la fuente de ADN sea particularmente ventajosa. Un alelo STR se define por el número de veces que se repite la secuencia repetida, definida anteriormente. (Imagen 1). 1 Los individuos son heterocigotos u homocigotos en cada locus. A medida que aumenta el número de loci STR que se evalúan, aumenta el poder estadístico de discriminación y la probabilidad de que otro individuo tenga el mismo perfil se vuelve cada vez más improbable y aumenta la detección de pequeñas diferencias. 3,4 En nuestro laboratorio, evaluamos un total de 21 loci diferentes.

Además, en nuestro laboratorio de HLA utilizamos STR para monitorear el estado de quimerismo en pacientes que se han sometido a un trasplante alogénico de células madre. Antes de su trasplante, los pacientes se emparejan con un donante a través de su sistema HLA (diferente de STR). Una vez que se confirma una compatibilidad de HLA, utilizamos el pretrasplante del paciente y la muestra del donante para generar alelos informativos de STR. Los alelos informativos son alelos que están presentes solo en el receptor y no en el donante. Estos alelos son importantes porque los trasplantes de células madre reemplazan la médula del receptor y la detección del ADN del receptor en las muestras posteriores al trasplante es crucial para identificar el rechazo o la recaída de su enfermedad. Además, los loci que contienen alelos informativos se definen como loci informativos, estos son los loci que luego se utilizan para identificar el porcentaje de quimerismo (Imagen 2).

Imagen 2. Donante y receptor (pretrasplante) están representados en los dos primeros electroferogramas. Las etiquetas verdes "D1R" representan alelos compartidos, las etiquetas azules "D1" representan alelos específicos del donante y las etiquetas marrones "R" representan alelos específicos del receptor. En el primer locus, AMEL, no hay alelos informativos y, por tanto, no es un locus informativo. En el siguiente locus, D3S1358, hay un alelo compartido, 15, un alelo del donante, 17 y un alelo informativo del receptor, 18. Los loci informativos tienen alelos informativos del receptor y pueden detectar la presencia de ADN del receptor en una muestra & # 8211 en en este caso, todos los loci siguientes después de AMEL son loci informativos. El CD3 (postrasplante) está representado en el tercer electroferograma. En este ejemplo, está claro que el paciente está teniendo algún tipo de falla del injerto o la reaparición de su enfermedad porque sus propias células, en lugar de solo las del donante, están presentes.

Cuando las células receptoras comienzan a resurgir, podemos detectar los picos de alelos relativos y asignarlos al receptor o donante haciendo referencia a los alelos informativos. Los picos de los alelos se utilizan a través de ecuaciones en nuestro software que miden el área debajo de estos picos definidos y luego calculan un quimerismo porcentual del donante. Una vez que se crea ese informe informativo, podemos comparar cualquier muestra posterior al trasplante para determinar el estado de quimerismo del paciente (Imagen 2).

Curiosamente, no aislamos simplemente el ADN del leucocitario posterior a la muestra como lo haríamos con otras muestras. Más bien, separamos cada muestra de publicación en un total de tres submuestras. El primero es simplemente la sangre periférica del paciente, nada extravagante. Los otros dos se aíslan del resto de la sangre periférica que no se usó en dos linajes celulares separados: linfocitos (CD3 +) y mielocitos (CD33 +). Este proceso es extremadamente laborioso, pudiendo procesar un conjunto de hasta 8-12 pacientes a la vez y cada conjunto tarda hasta 4-5 horas.

El proceso comienza tomando alícuotas de sangre periférica para el aislamiento del ADN (muestra 1) y tomando el resto y colocándolo en capas sobre un medio de separación de linfocitos (LSM). Luego, recolectando la capa de linfocitos / glóbulos blancos del LSM centrifugado. Luego pasamos a agregar cócteles de selección de anticuerpos CD3 y CD33 y perlas magnéticas. Luego, hacemos una serie de lavados con imanes y finalmente terminamos con nuestras poblaciones de células CD3 y CD33 purificadas. Su pureza se determina mediante citometría de flujo, un componente importante para confirmar que nuestros subconjuntos de leucocitos no están contaminados con otras poblaciones de leucocitos, ya que la contaminación anularía el propósito de analizar diferentes linajes.

Finalmente, tomamos el ADN aislado de las tres submuestras y lo amplificamos con cebadores específicos y etiquetas fluorescentes mediante PCR. Luego, las muestras se cargan en un instrumento de electroforesis capilar. Este instrumento detectará la longitud de cada fragmento, definida por los cebadores y las repeticiones dentro, y podrá identificar estos fragmentos a través del tamaño, etiquetas fluorescentes, láseres y detectores. Luego, el instrumento generará datos que podemos llevar a nuestra plataforma de análisis, que es ChimerMarker. A través de esto podemos analizar los datos y generar nuestros informes clínicos.

Aunque requiere mucho tiempo, el quimerismo específico de linaje es fundamental en el trasplante de células madre porque es más informativo y sensible que el análisis total de leucocitos, siendo varias magnitudes más sensibles que el análisis solo de sangre periférica. Permite la detección temprana de pequeñas poblaciones de células quiméricas que de otra manera podrían pasar desapercibidas, ya que un subconjunto en la sangre periférica puede "enmascarar" otro subconjunto que tiene un porcentaje creciente de células receptoras. El diagnóstico de estas poblaciones de células quiméricas de células pequeñas lo antes posible es fundamental para las intervenciones terapéuticas y la reducción de los rechazos de injertos. 2,5,6

Además, no solo es importante su detección, sino que a través de nuestro análisis podemos calcular el porcentaje de células donantes y células receptoras. A menudo informamos el porcentaje (%) de quimerismo del donante. Por ejemplo, un paciente 322 días después del trasplante podría tener un quimerismo del donante del 96% en su sangre periférica, del 100% en su linaje CD33 y del 73% en su linaje CD3. Luego, en el día 364 después del trasplante, pueden estar al 100% en su sangre periférica, al 100% en su linaje CD33 y al 92 por ciento en su linaje CD3. Dos cosas a notar en este ejemplo es que los porcentajes están cambiando (aumentando en el quimerismo del donante en este caso) y que la sangre periférica expresó un 100% de quimerismo en la segunda muestra a los 364 días, pero cuando miramos específicamente a la subpoblación CD3 a los 364 días todavía estaba presente el 8% de las células receptoras (Imagen 3 y 4).

Imagen 3. Muestras a los 322 días postrasplante. La sangre periférica reporta un 96% de quimerismo del donante. CD3 y CD33, purificados a partir de sangre periférica, informan un quimerismo del donante del 73% y del 100%, respectivamente. Imagen 4. Muestras a los 364 días postrasplante, mismo paciente que en la Imagen 3 anterior. La sangre periférica reporta un 100% de quimerismo del donante. CD3 y CD33, purificados a partir de sangre periférica, informan un quimerismo del donante del 92% y 100%, respectivamente.

Algunos estudios se han centrado no solo en las tendencias en el cambio de porcentajes, sino también en su constelación de porcentaje relativo. Por ejemplo, un estudio encontró que el aumento de las células CD3 receptoras tenía un factor predictivo aumentado de rechazo del injerto. También se encontró que otras poblaciones de subleucocitos aumentaron este poder predictivo. 5 Aún más, ha habido algunos estudios que han analizado el quimerismo y su utilidad para predecir la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). Esta enfermedad se define por los leucocitos del donante que atacan a los leucocitos y tejidos del receptor. A través de estos y otros hallazgos, el potencial y la aplicabilidad de la monitorización del quimerismo es extremadamente crucial para la atención del paciente durante la progresión de su trasplante. 2,5,6,7

Si bien el injerto es un proceso muy dinámico, que varía según los individuos y los tipos de enfermedades, el control del injerto es una forma de controlar y, en última instancia, influir en los enfoques terapéuticos. 2,5,6 Estoy orgulloso de poder contribuir al maravilloso equipo aquí en Northwestern University y me esfuerzo por aprender más sobre el proceso, tanto clínico como en el laboratorio. En artículos futuros, espero entrar en más detalles sobre el proceso y otros ensayos que realizamos.

¡Gracias por leer! ¡Hasta la proxima vez! ¡Manténgase sano y seguro durante estos tiempos inciertos!

  1. Tecnologías de la vida. 2014. Análisis de fragmentos de ADN por electroforesis capilar. Thermo Fisher Scientific. http://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf.
  2. Kristt, D., Stein, J., Yaniv, I. y Klein, T. (2007). Evaluación del quimerismo cuantitativo longitudinalmente: consideraciones técnicas, aplicaciones clínicas y viabilidad rutinaria. Trasplante de médula ósea, 39 (5), 255–268. doi: 10.1038 / sj.bmt.1705576
  3. Clark, JR, Scott, SD, Jack, AL, Lee, H., Mason, J., Carter, GI, Pearce, L., Jackson, T., Clouston, H., Sproul, A., Keen, L. , Molloy, K., Folarin, N., Whitby, L., Snowden, JA, Reilly, JT y Barnett, D. (2015), Monitoreo del quimerismo después del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (TCMH): recomendaciones técnicas para el uso de técnicas basadas en la repetición corta en tándem (STR), en nombre del Servicio Nacional de Evaluación de la Calidad Externa de Leucocitos del Reino Unido Grupo de trabajo de inmunofenotipificación de quimerismo. Br J Haematol, 168: 26-37. doi: 10.1111 / bjh.13073
  4. Análisis de repetición en tándem corto en el laboratorio de investigación. (2012). Obtenido el 10 de abril de 2020 de https://www.promega.com/resources/pubhub/short-tandem-repeat-analysis-in-the-research-laboratory/
  5. Breuer, S., Preuner, S., Fritsch, G., Daxberger, H., Koenig, M., Poetschger, U.,… Matthes-Martin, S. (2011). Prueba de quimerismo del receptor temprano en los linajes de células T y NK para la evaluación del riesgo de rechazo del injerto en pacientes pediátricos que se someten a un trasplante alogénico de células madre. Leucemia, 26(3), 509–519. doi: 10.1038 / leu.2011.244
  6. Buckingham, L. (2012). Diagnóstico molecular: fundamentos, métodos y aplicaciones clínicas. Filadelfia: F.A. Davis Company.
  7. Rupa-Matysek, J., Lewandowski, K., Nowak, W., Sawiński, K., Gil, L. y Komarnicki, M. (2011). Correlación entre la cinética del quimerismo de CD3 y la incidencia de enfermedad de injerto contra huésped en pacientes sometidos a trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. Procedimientos de trasplante, 43(5), 1915-1923. doi: 10.1016 / j.transproceed.2011.02.011

-Ben Dahlstrom es un recién graduado del programa MLS HealthSystem de la Universidad NorthShore. Actualmente trabaja como tecnólogo molecular para la Universidad Northwestern en su laboratorio de trasplantes, realizando tipificación de HLA en trasplantes de médula ósea y órganos sólidos. Sus intereses incluyen microbiología, molecular, inmunología y banco de sangre.


Discusión

La primera tecnología de tipificación de ADN introducida a mediados de la década de 1980 fue RFLP. El método RFLP de tipificación de ADN involucró unidades centrales de secuencias que constan de 30 a 100 nucleótidos que están presentes en muchas repeticiones (VNTR). El método RLFP de tipificación de ADN requiere ADN genómico intacto en grandes cantidades (20 a 30 mg). Sin embargo, las muestras biológicas recibidas en un laboratorio de ciencias forenses suelen sufrir agresiones ambientales y, en ocasiones, solo se pueden obtener pequeñas cantidades de ADN. Por tanto, en muchas situaciones, no se pudo aplicar el método RFLP.

El método de tipificación de ADN actualmente en uso es la tipificación STR. En este método, muchos loci compuestos por unidades centrales de nucleótidos repetidos hasta una longitud de 80 a 400 pares de bases pueden coamplificarse y los resultados pueden obtenerse en el mismo día mediante análisis automatizados de fragmentos de ADN. Esta tecnología es más superior que el método RFLP porque requiere cantidades mínimas de ADN (0,5 a 1 ng) y también se pueden analizar muestras degradadas.

El análisis de ADN ha sido fundamental para asegurar condenas en cientos de delitos violentos, desde homicidios hasta agresiones. También ha ayudado a eliminar sospechosos y ha dado lugar a la exoneración y liberación de personas previamente condenadas. El ADN puede enfocar las investigaciones y probablemente acortará los juicios y dará lugar a declaraciones de culpabilidad. También podría disuadir a algunos infractores de cometer delitos graves. El mayor uso de pruebas de ADN forense generará ahorros a largo plazo para el sistema de justicia penal.

Al almacenar datos de ADN en bancos de datos informáticos, el análisis de ADN se puede utilizar para resolver delitos sin sospechosos. Los científicos forenses pueden comparar perfiles de ADN de muestras de evidencia biológica con un banco de datos para ayudar a la policía a detectar sospechosos. Un banco de datos también permitiría que los delitos anteriores no resueltos en los que se hayan encontrado pruebas de ADN, pero no relacionadas con el delincuente, se aclaren si las muestras de ADN tomadas de un sospechoso en relación con un delito posterior coinciden con las pruebas encontradas en la escena del delito anterior. . Un banco de datos de ADN nacional también ayudaría a la policía a identificar a los delincuentes en serie tanto dentro como en todo el país.

El análisis de ADN forense se realiza en todo el mundo. Por lo tanto, es imperativo por parte de las naciones en desarrollo, incluida Malasia, desarrollar y compilar una base de datos nacional de ADN que consista en & # x0201c índice de perfil de ADN de la escena del crimen & # x0201d, & # x0201c índice de perfil de ADN del delincuente condenado & # x0201d, y un índice que contenga perfiles de ADN de Cuerpos y partes del cuerpo no identificados. Este esfuerzo, a su vez, garantizará las enmiendas apropiadas en las leyes penales para ayudar a las agencias de aplicación de la ley a identificar a las personas que presuntamente han cometido delitos graves y violentos y potenciar la recolección de muestras para la base de datos de perfiles de ADN. Hasta la fecha, ya hay datos publicados para 9 STR para tres grupos de población étnica de Malasia (malayos, chinos e indios) (21, 22) y actualmente se están realizando esfuerzos para tipificar subpoblaciones de malayos y comenzar el perfil de 15 STR recientemente validado. kit en varias poblaciones de Malasia. Una amplia base de datos y perfiles de ADN de los delincuentes y su indexación ayudarán a acelerar la detección de delitos.


Cómo funciona la evidencia de ADN

Desde la escena del crimen, una prueba de ADN viaja a un laboratorio forense. Estos laboratorios varían bastante, tanto en términos de cómo están estructurados como del tipo de análisis que ofrecen. Los laboratorios públicos a menudo están asociados con una entidad encargada de hacer cumplir la ley o la oficina del fiscal de distrito, mientras que otros son entidades gubernamentales independientes. También existen laboratorios forenses privados, algunos dedicados únicamente al análisis de ADN.

Muchos laboratorios tienen la capacidad de realizar pruebas en el ADN nuclear, que es la copia del ADN que existe en el núcleo de cada célula. Pero solo unos pocos laboratorios ofrecen técnicas más especializadas, como el análisis del cromosoma Y o del ADN mitocondrial. Veamos algunas de estas técnicas con mayor detalle.

Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) fue uno de los primeros métodos forenses utilizados para analizar el ADN. Analiza la longitud de las hebras de ADN que incluyen pares de bases repetidos. Estas repeticiones se conocen como número variable repeticiones en tándem (VNTR) porque pueden repetirse entre una y 30 veces.

El análisis RFLP requiere que los investigadores disuelvan el ADN en una enzima que rompe la hebra en puntos específicos. El número de repeticiones afecta la longitud de cada hebra de ADN resultante. Los investigadores comparan muestras comparando las longitudes de las hebras. El análisis RFLP requiere una muestra bastante grande de ADN que no se haya contaminado con suciedad.

Muchos laboratorios están reemplazando el análisis RFLP con repetición corta en tándem (STR) análisis. Este método ofrece varias ventajas, pero una de las más importantes es que puede comenzar con una muestra de ADN mucho más pequeña. Los científicos amplifican esta pequeña muestra mediante un proceso conocido como reacción en cadena de la polimerasa, o PCR. La PCR hace copias del ADN de manera muy similar a las copias del ADN en una célula, produciendo casi cualquier cantidad deseada de material genético.

Una vez que se ha amplificado el ADN en cuestión, el análisis STR examina la frecuencia con la que los pares de bases se repiten en loci o ubicaciones específicas en una hebra de ADN. Estas pueden ser repeticiones de dinucleótidos, trinucleótidos, tetranucleótidos o pentanucleótidos, es decir, repeticiones de dos, tres, cuatro o cinco pares de bases. Los investigadores a menudo buscan repeticiones de tetranucleótidos o pentanucleótidos en muestras que han pasado por amplificación por PCR porque es más probable que sean precisas.

La Oficina Federal de Investigaciones (FBI) ha elegido 20 loci STR específicos para que sirvan como estándar para el análisis de ADN. Ampliaron ese número de 13 a 20 en enero de 2017.


Mecanografía STR: método y aplicaciones

La incursión de este mes de The Primer en las técnicas de diagnóstico molecular cubrirá un método conocido como tipificación de repetición corta en tándem (STR). La tipificación de STR es un método que se aplica con más frecuencia en el trabajo de la medicina forense molecular, pero también se usa cada vez más en el laboratorio de patología molecular como un método para usar (o recurrir, según sea necesario) para rastrear y / o confirmar la "identidad" del tejido muestras. Si bien la primera aplicación obtiene más tiempo de pantalla en la televisión y las películas, es en el segundo contexto donde es probable que más lectores encuentren el método. Sin embargo, como veremos, el método real es idéntico en ambos usos.

Comprender las repeticiones cortas en tándem

Comenzamos considerando qué es realmente un STR. En todo el genoma humano, hay una gran cantidad de lugares ("loci") donde las secuencias de ADN no codificantes consisten en un elemento nucleotídico corto (generalmente 3 o 4), como "CGG" o "ACAG", que se presenta como un conjunto de repeticiones concateméricas. Para nuestros ejemplos, esto sería “CGGCGGCGG… .CGG” y “ACAGACAGACAG… .ACAG”, respectivamente. Cuando la replicación del ADN ocurre a través de este tipo de elementos, puede ocurrir un tipo particular de error: si la hebra naciente (en crecimiento) se desprende de la plantilla momentáneamente, cuando se vuelve a templar, puede hacerlo efectivamente con un "deslizamiento" de alguna unidad. número de repeticiones, lo que permite restablecer casi todo el emparejamiento de bases. Es decir, después de la desnaturalización y el recocido de la hebra naciente en la plantilla, la polimerasa puede estar "delante de" o "detrás" de donde estaba cuando se fue. A medida que la replicación comienza de nuevo, la cadena naciente ha “omitido” algunas de las repeticiones de la plantilla o las ha leído como plantilla dos veces. El primero da como resultado una hebra de ADN hija con una pérdida de un número unitario de repeticiones de STR, mientras que el segundo produce una hebra hija con un mayor número de repeticiones de STR.

¿Con qué frecuencia ocurre este "deslizamiento" de la polimerasa en una región STR? La frecuencia puede variar con varios factores, pero la respuesta general es: rara, pero con la frecuencia suficiente para que una población muestre un rango de números repetidos de STR en un locus dado.

Si bien los loci STR se encuentran dispersos por todo el genoma humano, un pequeño número se conoce particularmente bien. Estos son los que ocurren en una región flanqueada por secuencias únicas altamente conservadas, de modo que las secuencias únicas no están demasiado juntas, ni demasiado separadas, para una amplificación por PCR efectiva basada en cebadores contra las regiones únicas (aproximadamente, 50 a 500 bases pares). Cuando existe un elemento STR como este, es posible diseñar cebadores de PCR contra las regiones conservadas flanqueantes y saber que (gracias a la conservación) el conjunto de cebadores amplificará un producto de cualquier muestra de ADN humano intacta. En realidad, cuando los loci STR en cuestión están en un autosoma como la mayoría, entonces una muestra de ADN humano tendrá dos copias de loci (una del ADN derivado de la madre y otra del derivado del padre), por lo que se amplificarán dos productos de PCR. El detalle importante aquí es que, si bien sabemos que se formará un producto de PCR (o dos productos), no lo sabemos a priori cuánto durarán los productos. Esa longitud dependerá del número de repeticiones de STR entre los sitios del cebador de PCR. Los loci STR más útiles son aquellos en los que los estudios de población han mostrado una amplia diversidad de repeticiones encontradas, digamos, de 5 a 30. Este rango de 25 "números de repetición" para un elemento de repetición de trinucleótidos daría lugar a un rango de 75 pares de bases ( es decir, 25 x 3) de posibles tamaños de amplicón, en pasos de tres bases por repetición.

Conocidos por nombres de loci como "D1S80" o, a veces, por genes cercanos "TPOX", un puñado particular de loci STR cumple estos criterios de utilidad y están bien estudiados, con conjuntos de cebadores publicados para su amplificación y estadísticas de población conocidas para números de repetición individuales en cada locus — es decir, para un locus, en una población étnica dada, algunos números repetidos se encuentran comúnmente y otros se encuentran con menos frecuencia.

Encontrar una huella dactilar de ADN

Con esto en mente, imagine que tomamos un conjunto de cebadores para un locus STR autosómico y realizamos una PCR de punto final simple en una muestra humana. Al final de la PCR, analizamos el tamaño de los productos de la PCR. Como estamos buscando pasos de 3 nt o 4 nt, la electroforesis en gel no nos dará una resolución lo suficientemente buena como para distinguir productos que difieran en uno o dos números repetidos, por lo que empleamos secuenciadores de electroforesis capilar para leer los tamaños de los productos exactamente al nucleótido. Nuestra muestra puede mostrar un producto de un solo tamaño (lo que indica que ambas copias de loci tenían el mismo número de repetición), o puede mostrar dos productos, que difieren en los números de repetición (Figura 1). Para los loci examinados, ahora conocemos los números de repetición asociados con esa muestra de ADN.

Ahora imagina que tomamos una segunda muestra de ADN y repetimos el experimento. Si lo hacemos y obtenemos un resultado diferente al de la primera muestra, tenemos la ineludible conclusión de que las dos muestras de ADN provienen de diferentes individuos. Sin embargo, si obtenemos los mismos resultados que la primera muestra, no podemos decir que las muestras son del mismo individuo. Eso es porque es posible (hasta cierto nivel estadístico, dependiendo de la frecuencia poblacional del resultado obtenido para este locus) que otra persona tenga los mismos números de repetición que estos loci.

La técnica gana poder cuando probamos múltiples loci STR en cada espécimen. La probabilidad de que dos muestras coincidan exactamente disminuye rápidamente a medida que examinamos más loci. Una prueba comercial de STR de uso común examina 16 loci (15 autosómicos y un cromosómico sexual de caso especial que se analiza más adelante) con tasas de especificidad declaradas (es decir, probabilidad de que dos individuos coincidan con todos los loci) de 1 en 1.8 × 10 17 individuos o más— es decir, ¡muchas veces la población humana total del planeta! Comúnmente conocida como una "huella digital de ADN", con probabilidades de esa escala, no es de extrañar que la evidencia de ADN se aplique cada vez más en usos forenses y criminales, tanto en entretenimientos populares como en medicina forense de la vida real.

Relaciones significativas

Además de determinar (o refutar) la identidad entre dos muestras, la técnica también se puede utilizar para determinar la relación. La mitad de los números de repetición de los loci STR de cualquier individuo deben coincidir con los valores de la fuente materna y la otra mitad con los de la fuente paterna. Los hermanos generalmente deben coincidir en una cuarta parte de los loci, y así sucesivamente, a través de relaciones genéticas mendelianas simples. Se puede emplear un análisis estadístico detallado (incluida la frecuencia de población de los tipos de STR particulares observados) para refinar datos de este tipo y probar o refutar los niveles de relación entre las muestras, con una probabilidad estadística conocida. Tenga en cuenta que desde de novo Pueden ocurrir eventos de deslizamiento de STR y / o errores experimentales, una sola discrepancia con los valores esperados no refuta definitivamente la relación, una coincidencia entre los loci restantes puede ser suficiente para tener una alta certeza de relación.

Ahora que entendemos cómo se aplica esta metodología a las aplicaciones populares, ¿qué pasa con las más mundanas? El poder y la simplicidad del método de "huellas dactilares" de STR, combinado con su fácil disponibilidad en formatos de kits optimizados prefabricados, que se ejecutan fácilmente en equipos de laboratorio que ya están generalmente presentes en el laboratorio de patología molecular, lo convierten en una herramienta útil para rastrear y / o confirmar la relación en muestras (o piezas de muestras). Considere un caso como una biopsia de tumor potencial, en el que se pueden incrustar varios trozos pequeños de tejido en un solo bloque de FFPE. Se realiza un análisis inmunohistoquímico de rutina y el resultado muestra que la mayoría de las piezas de tejido no son cancerosas, mientras que una sola pieza pequeña sí lo es. En casos como este, una preocupación que cruza la mente del patólogo puede ser si todos los trozos de tejido son de hecho de la misma muestra, o si un "flotador" de otro caso se ha introducido de alguna manera en el bloque. Si bien se protege cuidadosamente, estos casos no son imposibles y pueden tener graves consecuencias para el paciente. El método de tipificación de STR puede ser una herramienta muy útil en un caso como este, donde una sección microscópica de la pieza de tejido en cuestión puede servir como plantilla para una huella dactilar de ADN, con una muestra de referencia del paciente proporcionando otra. Una coincidencia confirma la “relación” (o no) de la pieza de tejido y el paciente, asegurando un diagnóstico correctamente asignado.

Un locus STR particular en los cromosomas sexuales se mencionó anteriormente. Ocurriendo dentro del gen de la amelogenina, esto no es estrictamente un STR clásico donde el tamaño de un elemento repetido puede variar más bien, resulta que la versión del gen de la amelogenina transportada en el cromosoma X (AMELX dos veces en mujeres y una vez en hombres) no es exactamente idéntica en longitud a la misma región del gen de la amelogenina que se encuentra en el cromosoma Y (AMELY una vez en los hombres). Un intrón en AMELY contiene una inserción de 6 bases en relación con el mismo intrón en AMELX. (Tenga en cuenta que, dado que la inserción está en un intrón, las porciones del gen codificante son idénticas). Cuando se amplifican mediante cebadores que flanquean esta región, los productos derivados de AMELY son, por tanto, 6 pb más largos que los derivados de AMELX. El conjunto de cebadores más comúnmente utilizado para este locus produce un único producto de 106 pb (dos copias de loci, mismo tamaño) para muestras de ADN de hembras, y un producto de doblete de 106/112 pb (uno de cada locus) de machos. Por lo tanto, esta prueba de locus único determina de manera efectiva la entrada (o salida) de aproximadamente la mitad de la población como posibles fuentes para cualquier muestra de ADN dada, y se incluye de forma rutinaria en los paneles de tipificación de STR. Dado su tamaño, este locus también es apenas diferenciable en un gel de agarosa con una buena técnica, lo que lo convierte en una buena demostración en el aula del enfoque general, sin necesidad de acceder a un instrumento secuenciador capilar.

¿Qué pasa con las muestras mixtas? El método descrito anteriormente ha asumido que cada muestra probada proviene de una sola fuente y funciona mejor en esta situación "perfecta". Sin embargo, en casos de la vida real con pequeñas cantidades proporcionales de otro ADN presente, el método aún funciona. La plantilla principal producirá la mayor parte del producto, con pequeñas cantidades de producto derivadas de la plantilla contaminante. Los secuenciadores capilares muestran el área de pico real para cada producto detectado, por lo que la muestra primaria mostrará un conjunto importante de picos con picos laterales pequeños atribuibles al contaminante.

Volver a Figura 1: un esquema de resultados de STR hipotéticos para cuatro marcadores de STR "A", "B", "C" y "D" Las muestras 1, 2 y 3 representan tres muestras diferentes analizadas para estos marcadores, como resultado de la electroforesis capilar sin procesar. Cada muestra contiene dos estándares de tamaño fijo, "R1" y "R2", que se utilizan para garantizar la alineación de los resultados entre las muestras. Cada electroferograma en sí mismo muestra la fuerza de la señal frente al tamaño del producto y se divide en las regiones "A", "B", "C" y "D". Cada región representa el rango esperado de posibles tamaños de amplicón del marcador STR del mismo nombre. Considerando la Muestra 1, se puede ver que la fuente es heterocigótica para los tamaños de STR en los marcadores A, C y D, (dos productos distintos formados en tamaños específicos) pero es homocigota para ambos alelos del marcador B. (Hay dos productos, pero de tamaño idéntico, produciendo un solo pico). La muestra 2 tendría una relación genética muy baja con la muestra 1, tenga en cuenta que en esta muestra, los marcadores STR B, C y D son heterocigotos mientras que A es homocigoto, y que en general, pocos de los tamaños de alelos se alinean entre las Muestras 1 y 2. Por el contrario, la Muestra 3 es exactamente igual que la Muestra 1, lo que sugiere identidad (o al menos, un alto grado de relación). Un resultado de STR real se vería similar a esto pero con más marcadores, lo que permitiría un mayor poder estadístico en la detección de falta de relación.

John Brunstein, PhD, miembro de la MLO Editorial Advisory Board, es presidente y CSO de PathoID, Inc., con sede en Columbia Británica.


Roepat Str - Historia

La mayor parte de nuestro ADN es idéntico al ADN de otros. Sin embargo, hay regiones heredadas de nuestro ADN que pueden variar de persona a persona. Las variaciones en la secuencia de ADN entre individuos se denominan "polimorfismos". Como descubriremos en esta actividad, las secuencias con mayor grado de polimorfismo son de gran utilidad para el análisis de ADN en casos forenses y pruebas de paternidad. Esta actividad se basa en analizar la herencia de una clase de polimorfismos de ADN conocidos como "Short Tandem Repeats", o simplemente STRs.

Los STR son secuencias cortas de ADN, normalmente de 2-5 pares de bases de longitud, que se repiten numerosas veces en forma de cabeza a cola, es decir, la secuencia de 16 pb de "gatagatagatagata" representaría 4 copias de cabeza a cola del tetrámero "gata". . The polymorphisms in STRs are due to the different number of copies of the repeat element that can occur in a population of individuals.

D7S280

D7S280 is one of the 13 core CODIS STR genetic loci. This DNA is found on human chromosome 7. The DNA sequence of a representative allele of this locus is shown below. This sequence comes from GenBank, a public DNA database. The tetrameric repeat sequence of D7S280 is "gata". Different alleles of this locus have from 6 to 15 tandem repeats of the "gata" sequence. How many tetrameric repeats are present in the DNA sequence shown below? Notice that one of the tetrameric sequences is "gaca", rather than "gata".


TH01

We have made and will continue to make great efforts to ensure the accuracy and completeness of the data included in this STR database. Information will be added from time-to-time to keep this site as up-to-date as possible. The National Institute of Standards and Technology (NIST) is in no way responsible for information provided through this site, including hyperlinks to commercial sources of materials. Certain commercial vendors are identified in this web site to benefit the DNA typing community. In no case does such identification imply a recommendation or endorsement by NIST nor does it imply that the material, instrument or equipment identified is necessarily the best available for human identity testing.

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The Geriatric Patient

Steven J. Schwartz MD , Frederick E. Sieber MD , in Anesthesia and Uncommon Diseases (Sixth Edition) , 2012

Diagnosis and Differential

The DNA-repeat expansion forms the basis of a diagnostic blood test for the disease gene. Patients having 38 or more CAG repeats in the Huntington's disease gene have inherited the disease mutation and will eventually develop symptoms if they live to an advanced age. Each of their children has a 50% risk of also inheriting the abnormal gene a larger number of repeats is associated with an earlier age at onset. Huntington's can also be diagnosed by caudate atrophy on magnetic resonance imaging (MRI) in the context of an appropriate clinical history.

Differential diagnosis of Huntington's disease includes other choreas, hepatocerebral degeneration, schizophrenia with tardive dyskinesia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and other primary dementias and drug reactions.


Performing STR Analysis

This method differs from RFLP since in STR analysis DNA is not cut with restriction enzymes. Probes are attached to preferred regions on the DNA, and a PCR is employed to discover the lengths of the short tandem repeats.

The whole process for STR typing comprisesof collection of sample, extraction of DNA, quantisation of DNA, amplification of multiple STR loci by PCR, separation and sizing of STR allele, STR typing followed by profile interpretation, and possibly a report of the statistical significance of a match. Current forensic systems apply 10 (e.g. United Kingdom) or 13 (e.g. United States) STR loci. Kits with PCR primers for the standard STR loci are available commercially.

Numerous PCR reactions are performedconcurrently in a single tube at different STR loci, which give several products (two for each locus). The required components are as follows:

§ A DNA sample, e.g. blood or buccal cells from a suspect or a tissue, hair, nail from the scene of a crime

§ Two oligonucleotide PCR primers: one unlabelled reverse primer and one primer labelled at the 5 ′ -end with 32 P

§ A DNA polymerase (thermos table)

§ Four deoxynucleoside triphosphates which are as follows: dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

The labelled PCR products separate according to size when run on a polyacrylamide gel. DNA ladder is obtained and works as characteristic of an individual (Fig.7) .



Repeat specific rows or columns on every printed page

If a worksheet spans more than one printed page, you can label data by adding row and column headings that will appear on each print page. These labels are also known as print titles.

Follow these steps to add Print Titles to a worksheet:

On the worksheet that you want to print, in the Page Layout tab, click Print Titles , en el Configuración de página grupo).

Nota: The Print Titles command will appear dimmed if you are in cell editing mode, if a chart is selected on the same worksheet, or if you don’t have a printer installed. For more information about installing a printer, see finding and installing printer drivers for Windows Vista. Please note that Microsoft has discontinued support for Windows XP check your printer manufacturer's Web site for continued driver support.

Sobre el Hoja tab, under Print titles, do one—or both—of the following:

En el Rows to repeat at top box, enter the reference of the rows that contain the column labels.

En el Columns to repeat at left box, enter the reference of the columns that contain the row labels.

For example, if you want to print column labels at the top of every printed page, you could type $1:$1 en el Rows to repeat at top box.

Tip: También puede hacer clic en el Collapse Popup Window buttons at the right end of the Rows to repeat at top y Columns to repeat at left boxes, and then select the title rows or columns that you want to repeat in the worksheet. After you finish selecting the title rows or columns, click the Collapse Dialog button again to return to the dialog box.

Nota: If you have more than one worksheet selected, the Rows to repeat at top y Columns to repeat at left boxes are not available in the Configuración de página caja de diálogo. To cancel a selection of multiple worksheets, click any unselected worksheet. If no unselected sheet is visible, right-click the tab of a selected sheet, and then click Ungroup Sheets on the shortcut menu.